ELISA

ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

Pendahuluan

Metode Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan suatu teknik immunoassay yang digunakan untuk mendeteksi atau mengetahui kuantitas atau kadar dari suatu zat berdasarkan reaksi imunologis. Metode ELISA yang rutin digunakan format microplate standar dengan 8 baris dan 12 kolom sehingga terdapat 96 sumuran. Oleh karena itu, dengan ELISA kita dapat mendeteksi kuantitas atau kadar dari beberapa konsentrasi zat sekaligus. Pada format microplate yang lain terdapat 16 kolom atau lebih dengan 24 kolom atau lebih, sehingga terdapat lebih dari 384 sumuran.

Secara singkat, prinsip metode ELISA adalah dengan membuat berikatannya antibodi spesifik (antibodi primer) dengan protein target pada sumuran microplate ELISA yang sudah terdapat berbagai konsentrasi protein yang akan diukur. Selanjutnya kompleks protein yang telah berikatan dengan antibodi spesifiknya tersebut akan dapat berikatan dengan antibodi lain yang telah mengandung biotin (antibodi sekunder). Selanjutnya diberikan substrat (misalnya ABTS atau TMB) untuk membuat terjadinya colorimetric reaction berdasarkan dari aktivitas avidin-horseradish peroxidase pada substrat yang berikatan dengan biotin pada antibodi sekunder. Hasil akhir dari reaksi tersebut adalah adanya perubahan warna cairan pada well microplate. Optical density produk hasil dari rangakaian metode ELISA ini diukur dengan menggunakan spectrophotometer.

Spectrophotometer adalah sebuah alat yang dapat mengukur jumlah dari cahaya yang menembus sumuran dari microplate. Kompleks antigen-antibodi yang kita buat pada well mcroplate akan memberikan perubahan warna pada cairan tersebut, sehingga akan memberikan optical density yang berbeda. Optical density dapat dinyatakan meningkat atau menurun berdasarkan pengenceran material standart, sehingga akan menghasilkan kurva dose-response yang nantinya akan digunakan untuk mengestimasi kadar protein tersebut.

Pada praktikum pelatihan ELISA ini akan dilakukan pengukuran terhadap kadar IL-6 dari sampel yang telah disediakan.

Tujuan

1. Melatih mahasiswa biomedik untuk dapat melakukan ELISA

2. Mengukur konsentrasi IL-6 dari sampel yang telah disediakan

Metode

Bahan penelitian:

1. Coating buffer

-       Na₂CO₃                         0.159 g

-       NaHCO₃            0.293 g

-       NaN₃                  0.02 g

-       Add H₂O            till 100 ml

-       Adjust pH 9.6

2. PBS (Phosphat Buffer Saline)

-       NaH₂PO₄           0.24 g

-       Na₂HPO₄           0.12 g

-       KH₂PO₄                         0.07 g

-       KCl                     0.68 g

-       Add H₂O            till 100 ml

-       Adjust pH 7.4

3. PBS-Tween (wash buffer)

-       PBS                   100 ml

-       Tween-20          50 μL

4. Blocking buffer (1% BSA)

-       BSA                   0.1 g

-       PBS                   10 mL

5. Stop solution (H₂SO₄ 2N)

-       H₂SO₄               0.55 mL

-       Add H₂O            till 10 mL

6. Sampel IL-6

7. Antibodi IL-6

8. Anti-Rabbit igG

Prosedur ELISA

1. Siapkan plate ELISA dan Plate Layout

Standart: 1 Sample: 2

Gambar 1 Plate Elisa

1-A: Blanko IL-6                 2-A: 3

1-B: 1 μg                             2-B: 12

1-C: 0,1 μg                         2-C: 16

1-D: 0,01 μg                       2-D: 9

1-E: 0,001 μg                      2-E: 14

1-F: 0,0001 μg                    2-F: 6

1-G: 0,00001 μg                 2-G: 5

1-H: 0,000001 μg               2-H: 4

2. Coating antigen

a. Serum: coating buffer = 1: 25 @ 100µl

b. BUngkus dengan alumunium foil

c. Inkubasi dalam suhu 40 selmalam

d. Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl             

3. Coating Blocking buffer (supaya menutupi antigen yang tidak kita inginkan)

a. 1% BSA-PBS @ 100 µl

b. Bungkus dengan alumunium foil

c. Inkubasikan selama 1 jam pada suhu ruangan

d. Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl

4. Coating antibody primer (mengikat antigen spesifik yang sudah kita coating sebelumnya)

a. Mouse anti-human antibody : Blocking Buffer = 1: 500 @ 100 µl

b. Bungkus dengan alumunium foil

c. Inkubasikan selama 2 jam pada suhu ruangan

d. Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl

5. Coating antibody sekunder (untuk mengikat antibody spesifik yang supah kita coating sebelumnya, dan memberikan tempat untuk molekul pewarnanya)

a. Rabbit anti-mouse IgG Biotin conjugate : PBS = 1: 1000 @ 100 µl

b. Bungkus dengan alumunium foil

c. Inkubasikan selama 1 jam pada suhu ruangan

d. Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl

6. Coating enzim

a. SAHRP : PBS = 1:1000 @ 100 µl

b. Bungkus dengan alumunium foil

c. Inkubasikan selama 1 jam pada suhu ruangan

d. Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl

7. Substrat dan Stop solution

a. Teteskan substrat Tetramethyl benzydine (TMB) @ 50 µl

b. Inkubasi selama 30 menit dalam suhu ruangan

c. Tambahkan H2SO4 2N @ 50 µl

d. Inkubasikan selama 10 menit pada suhu ruangan

8. Baca dengan ELISA reader (Spectrophotometer) pada λ 450 nm 3 kali tiap 5 menit

Hasil

1. Standart IL-6

Standard	Conc. (ng/ml)	OD
1	1000	0.773
2	100	0.298
3	10	0.076
4	1	0.181
5	0.1	0.169
6	0.01	0.248
7	0.001	0.679

Kurva standart disebut baik apabila R²-nya mendekati 1. Pada hasil ELISA ini didapatkan nilai R² pada kurva 0,4823, akibatnya kurva standart ini tidak dapat digunakan. Oleh karena itu digunakan kurva standart lain untuk membantu pembelajaran menghitung kadar IL-6 meskipun seharusnya menggunakan standart lain juga tidak diperbolehkan.

2. Satandart uPAR

Standard	Conc. (ng/ml)	OD		Avg OD	log conc.	log O.D
1	0	0.076		0
2	62.5	0.095	0.112	0.0275	1.795880017	-1.56067
3	125	0.129	0.139	0.058	2.096910013	-1.23657
4	250	0.186	0.194	0.114	2.397940009	-0.9431
5	500	0.285	0.302	0.2175	2.698970004	-0.66254
6	1000	0.48	0.497	0.4125	3	-0.38458
7	2000	0.864	0.971	0.8415	3.301029996	-0.07495
8	4000	1.841	1.869	1.779	3.602059991	0.250176

Pada standart uPAR tersebut, diketahui R²-nya 0,9994 yaitu mendekati 1, oleh karena itu kurva ini merupakan kurva yang dapat diterima untuk menghitung kadar sampel dalam pembelajaran ini. Namun seharusnya menghitung kadar IL-6 dengan standart zat lain tidak diperbolehkan

3. Korelasi sampel

Nama Sampel	Absorbansi	Log Absorbansi	Log Konsentrasi	Konsentrasi (dalam pengenceran)	Real Konsentrasi
3	0.07	-1.15490196	2.196853996	157.3453801	3933.634503
12	0.166	-0.779891912	2.57718873	377.7363072	9443.40768
16	0.058	-1.236572006	2.114024334	130.0242431	3250.606077
9	0.888	-0.051587034	3.315834651	2069.353333	51733.83333
14	0.121	-0.91721463	2.437916197	274.10452	6852.612999
6	0.044	-1.356547324	1.992345514	98.25293076	2456.323269
5	0.044	-1.356547324	1.992345514	98.25293076	2456.323269
4	0.052	-1.283996656	2.065926312	116.3928526	2909.821314

Dari perhitungan menggunakan kurva uPAR diatas, didapatkan konsentrasi IL-6 (dalam nano liter) pada masing masing sampel.

Diskusi

Pada pelatihan penelitian ini secara garis besar langkah-langkah ELISA sudah dilakukan dengan teratur dan semua peserta telah mengetahui dasar teori dan prosedur dari ELISA ini, namun didapatkan ketidak akuratan pada hasil standart IL-6, hal tersebut dikarenakan pipetting yang tidak konsisten, karena pipetting dilakukan oleh oleh masing-masing peserta pelatihan. Masing-masing peserta memiliki keakuratan yang berbeda dalam pipetting sehingga mungkin terdapat kesalahan pipetting oleh sebagian peserta. Selain itu pada saat washing dengan cara menghentakkan plate ELISA gengan tegas, kekuatan dari para peserta pelatihan juga berbeda, sehingga kemungkinan peserta yang memiliki kekuatan lebih, secara tidak sengaja terlalu kuat saat menghentakkan dan sebagian ikatan antigen-antibodi yang telah ter-coating dapat terlepas dan terbuang. Oleh karena itu metode ELISA seharusnya dilakukan oleh 1 orang saja sehingga keakuratan dan kekuatan dalam melaksanakan langkah-langkah ELISA akan stabil.

Karena tidak dapat diperoleh standart IL-6 yang akurat, maka untuk melanjutkan pelatihan yaitu cara menghitung kadar IL-6 dari sampel, maka diambilah standart dari sampel lain (uPAR) yang memiliki tingkat keakuratan tinggi. Seharusnya standart yang digunakan adalah standart yang di-running bersama dengan sampel pada saat yang bersamaan. Meskipun zat yang diukur sama, kita tidak boleh menggunakan standart suatu zat dari ELISA sebelumnya untuk digunakan pada ELISA yang sedang di-running, apalagi menggunakan standart zat yang berbeda. Namun tujuan utama ELISA ini adalah sebagai pelatihan sehingga lebih mementingkan pada cara dan prosedur yang dilakukan saat ELISA termasuk cara menghitung kadar suatu zat. Dengan menggunakan standart uPAR, hasil absorbansi IL-6 dapat dimasukkan ke dalam persamaan kurva standart uPAR sehingga dapat diketahui kadar Il-6 pada masing-masing sampel.

Untuk menghitung kadar dari IL-6 digunakan cara regresi linier, sama dengan cara yang digunakan untuk elektroforesis, namun persamaan garis yang dipakai pada standart adalah persamaan logaritma. Persamaan garis yang dipakai ada bermacam macam, tergantung dari kit yang kita gunakan atau dengan pendekatan hubungan titik-titik hasil spectrophotometri menjadi sebuah persamaan garis. Pertama, absorbansi atau optical density IL-6 hasil spectrophotometri dibuat pada tabel pada Ms. Exel. Selanjutnya dibuat logaritma dari data absorbansi tersebut dan dibuat logaritma dari konsentrasi standart. Kemudian dibuatlah persamaan garis terhadap Log absorbansi dan Log konsentrasi dengan sumbu X sebagai Log konsentrasi dan sumbu Y sebagai Log absorbansi. Absorbansi dari sampel selanjutnya juga dibuat logaritmanya. Dengan persamaan garis tersebut, dapat dihitung dan diketahui logaritma konsentrasi dari IL-6. Berikutnya dibuat anti-logaritma dari Log konsentrasi IL-6 yang sudah didapatkan, sehingga akan diketahui konsentrasi IL-6. Namun konsentrasi IL-6 ini adalah konsentrasi dalam pengenceran 25 kali, sehingga untuk mengetahui konsentrasi IL-6 sesungguhnya dalam sampel, konsentrasi yang telah kita dapat ini dikali 25. Dari perhitungan regresi linier tersebut dapat diketahui konsentrasi IL-6 pada masing-masing sampel.

Kesimpulan

1. Mahasiswa biomedik dapat melakukan prosedur ELISA dengan baik dan menghitung kadar IL-6 dengan menggunakan regresi linier pada pelatihan prosedur ELISA ini

2. Diketahui kadar IL-6 pada sampel 3 adalah 157,35 ng/ml, sampel 12 adalah 377,74 ng/ml, sampel 16 adalah 130,02 ng/ml, sampel 9 adalah 2069,35 ng/ml, sampel 14 adalah 274,1, sampel 6 adalah 98,25, sampel 5 adalah 98,25, dan sampel 4 adalah 116,39 dengan menggunakan standart uPAR.