imunohistokimia

IMUNOHISTOKIMIA (IHK)

Pendahuluan

Imunohistokimia adalah suatu metode kombinasi dari anatomi, imunologi dan biokimia untuk mengidentifikasi komponen jaringan yang memiliki ciri tertentu dengan menggunakan interaksi antara antigen target dan antibodi spesifik yang diberi label. Dengan menggunakan imunohistokimia, kita dapat melihat distribusi dan lokalisasi dari komponen seluler spesifik diantara sel dan jaringan lain di sekitarnya dengan menggunakan mikroskop cahaya biasa. Komponen seluler tersebut dapat terlihat karena kompleks antigen-antibodi yang sudah dilabel akan memberikan warna yang berbeda dari sekitarnya.

Imunohistokimia dibagi menjadi 2 metode, yaitu metode direct dan indirect. Pada metode direct, antibodi spesifik yang mengenali antigen jaringan akan dimodifikasi dengan mengkonjugasikan molekul indikator pada antibodi tersebut. molekul indikator tersebut dapat berupa molekul yang berpendar seperti biotin atau enzim peroksidase, sehingga apabila diberikan substrat akan memberikan warna pada jaringan tersebut. Selanjutnya dalah metode indirect, pada metode ini antibodi spesifik yang mengenali antigen jaringan disebut sebagai antibodi primer dan tidak dilakukan modifikasi pada antibodi ini. Namun diperlukan antibodi lain yang dapat berikatan dengan antibodi primer yang disebut dengan antibodi sekunder. Antibodi sekunder ini dimodifikasi sehingga memiliki molekul indikator pada antibodi tersebut. Setiap 1 antibodi primer dapat dikenali oleh lebih dari 1 antibodi sekunder, oleh karena itu, setelah diberikan substrat akan terbentuk warna yang lebih jelas pada jaringan tersebut.

Langkah-langkah dalam melakukan imunohistokimia dibagi menjadi 2, yaitu preparasi sampel dan labeling. Preparasi sampel adalah persiapan untuk membentuk preparat jaringan dari jaringan yang masih segar. Preparasi sample terdiri dari pengambilan jaringan yang masih segar, fiksasi jaringan biasanya menggunakan formaldehid, embedding jaringan dengan parafin atau dibekukan pada nitrogen cair, pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom, deparafinisasi dan antigen retrieval untuk membebaskan epitop jaringan, dan bloking dari protein tidak spesifik lain. Sampel labeling adalah pemberian bahan-bahan untuk dapat mewarnai preparat. Sampel labeling terdiri dari imunodeteksi menggunakan antibodi primer dan sekunder, pemberian substrat, dan counterstaining untuk mewarnai jaringan lain di sekitarnya.

Tujuan

1. Melatih mahasiswa biomedik untuk dapat melakukan Imunohistokimia

2. Melihat sel kanker pada preparat jaringan buli-buli dari hasil Imunohistokimia

Metode

Hari pertama

1. Deparaffinisasi

a. Teteskan  Xylol 2x10 menit

b. Teteskan ethanol absolute 1x5 menit

c. Teteskan ethanol 90% 1x5 menit

d. Teteskan ethanol 80% 1x5 menit

e. Teteskan ethanol 70% 1x5 menit

f. Teteskan Sterile aquades 3x5 menit

2. Slide siap untuk dilakukan Imunohistokimia :

a. Dicuci PBS steril 3x5 menit

b. Dikeringkan dengan tissue

c. Ditambah H2O2 3% dalam methanol inkubasi 15 sampai dengan 20menit

d. Dicuci PBS steril3x5 menit

3. Blocking unspesifik protein :

a. Ditambah 0,255 triton-x100 dalam blocking buffer BSA selama 1 jam pada suhu ruang

b. Dicuci dengan PBS steril 3x5 menit

4. Inkubasi antibodi primer :

a. Ditambah antibodi primer dalam blocking buffer BSA

b. Inkubasi semalam pada 4°C

c. Dicuci PBS steril 3x5 menit

Hari kedua

1. Inkubasi antibodi sekunder :

a. Ditambah antibodi sekunder kit, inkubasi 60 menit pada suhu kamar (walapun menggunakan kulkas harus menggunakan lap supaya terjaga kelembabannya)

b. Dicuci PBS steril 3x5 menit

2. Inkubasi SAHRP :

a. Ditambah SAHRP kit, inkubasi 40 menit pada suhu kamar

b. Dicuci PBS steril 3x5 menit

c. Dicuci akuades steril 3x5 menit

3. Aplikasi kromagen DAB (dipilih DAB karena lebih awet) :

a. Ditambah (DAB :buffer DAB = 1:50), inkubasi 20 menit pada suhu kamar

b. Dicuci PBS steril 3x5 menit diaminobenzidine

4. Counterstain dengan mayer hematoxilen :

a. Ditambah (mayer : tap water =1:10), inkubasi 5-10 menit pada suhu kamar

b. Dicuci tap water steril 3x5 menit

c. Dikeringkan anginkan

5. Mounting dengan entellan

Dikeringkan anginkan

6. Amati preparat yang telah dilakukan Imunohistokimia di bawah mikroskop

 

Hasil

 

Gambar hasi Imunohistokimia

Dari Imunohistokimia pada preparat jaringan buli-buli yang diperkirakan terdapat sel kanker, sel kanker tersebut akan terwarnai dengan warna coklat. Dari preparat pertama didapatkan sedikit warna coklat, sehingga diperkirakan hanya ada sedikit jumlah sel kanker, sedangkan pada preparat kedua dan ketiga terdapat banyak warna coklat sehingga diperkirakan ada banyak sel kanker pada jaringan buli-buli tersebut.

Diskusi

Pada pelatihan penelitian ini langkah-langkah Imunohistokimia sudah dilakukan dengan teratur dan semua peserta telah mengetahui dasar teori dan prosedur Imunohistokimia ini. Namun proses preparasi sampel tidak seluruhnya dilakukan oleh peserta. Preparasi sampel terdiri dari pengambilan jaringan yang masih segar, fiksasi jaringan biasanya menggunakan formaldehid, embedding jaringan dengan parafin atau dibekukan pada nitrogen cair, pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom, deparafinisasi dan antigen retrieval untuk membebaskan epitop jaringan, dan bloking dari protein tidak spesifik lain. Peserta pelatihan memulai pada saat preparat sampel sudah dilakukan deparafinisasi, sehingga hanya proses bloking protein tidak spesifik dari proses preparasi sampel saja yang dilakukan oleh peserta. Namun telah dilakukan penjelasan secara rinci dari laboran biomedik tentang preparasi sampel. Proses antigen retrieval diperlukan setelah dilakukan deparafinisasi karena proses tersebut akan membuat epitop dari jaringan tersebut lebih terlihat atau lebih dominan dibandingkan dengan tidak dilakukan antigen retrieval sehingga nantinya antibodi primer yang diberikan akan dapat mengenali epitopnya dengan baik. Selanjutnya dilakukan bloking protein tidak spesifik, hal ini bertujuan untuk menutupi sisi protein lain, sehingga anti bodi tidak mengenali protein lain yang tidak dimaksud. Hal ini dapat mengurangi bias.

Pelatihan penelitian ini menggunakan teknik Imunohistokimia secara indirect. Pada proses selanjutnya adalah sampel labeling yang terdiri dari imunodeteksi menggunakan antibodi primer dan sekunder, pemberian substrat, dan counterstaining untuk mewarnai jaringan lain di sekitarnya. Antibodi primer yang digunakan adalah antibodi yang spesifik terhadap protein sel kanker buli-buli. Setelah diberikan antibodi primer, preparat dicuci, sehingga antibodi primer yang tidak berikatan akan terbuang. Berikutnya diberikan antibodi sekunder yang spesifik terhadap antibodi primer, sehingga antibodi sekunder ini akan berikatan dengan antibodi primer. Antibodi sekunder ini dimodifikasi sehingga memiliki molekul indikator pada antibodi tersebut. Pada pelatihan penelitian ini, molekul indikator yang digunakan adalah SAHRP yang berikatan dengan H₂O₂. Setiap 1 antibodi primer dapat dikenali oleh lebih dari 1 antibodi sekunder yang memiliki SAHRP. Selanjutnya diberikan kromagen diaminobenzidine (DAB). DAB ini akan bereaksi dengan H₂O₂ yang terdapat pada SAHARP antibodi sekunder dan akan dihasilkan produk reaksi berwarna coklat yang dapat kita lihat. Oleh karena lebih dari 1 antibadi sekunder yang berikatan dengan antibidi primer, maka DAB yang bereaksi dengan H₂O₂ akan semakin banyak dan akan menghasilkan warna yang lebih jelas dibandingkan dengan metode direct yang tidak menggunakan antibodi sekunder. Proses terakhir adalah counterstaining, yaitu memberikan warna lain pada jaringan yang tidak terwarnai oleh proses Imunohistokimia. Pada pelatihan penelitian ini menggunakan mayer hematoxilen sebagai counterstaining yang nantinya akan memberikan warna kebiruan pada jaringan lainnya. Counterstaining bertujuan untuk memberikan warna kontras terhadap hasil Imunohistikimia, sehingga jaringan berwarna coklat dapat terlihat jelas dibandingkan dengan jaringan sekitarnya. Pada hasil Imunohistokimia dari pelatihan penelitian ini, terlihat adanya sel kanker yang terwarna coklat diantara jaringan lain yang berwarna kebiruan.

Kesimpulan

1. Mahasiswa biomedik dapat melakukan prosedur Imunohistokimia dengan baik sehingga diperoleh preparat jaringan buli-buli dengan adanya warna coklat pada pelatihan prosedur Imunohistokimia ini.

2. Pada preparat jaringan buli-buli yang dilakukan Imunohistokimia menggunakan antibodi spesifik terhadap sel kanker buli-buli, terlihat adanya jaringan berwarna coklat yang menunjukkan sel kanker pada jaringan tersebut dengan menggunakan mikroskop cahaya.

ELISA

ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

Pendahuluan

Metode Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan suatu teknik immunoassay yang digunakan untuk mendeteksi atau mengetahui kuantitas atau kadar dari suatu zat berdasarkan reaksi imunologis. Metode ELISA yang rutin digunakan format microplate standar dengan 8 baris dan 12 kolom sehingga terdapat 96 sumuran. Oleh karena itu, dengan ELISA kita dapat mendeteksi kuantitas atau kadar dari beberapa konsentrasi zat sekaligus. Pada format microplate yang lain terdapat 16 kolom atau lebih dengan 24 kolom atau lebih, sehingga terdapat lebih dari 384 sumuran.

Secara singkat, prinsip metode ELISA adalah dengan membuat berikatannya antibodi spesifik (antibodi primer) dengan protein target pada sumuran microplate ELISA yang sudah terdapat berbagai konsentrasi protein yang akan diukur. Selanjutnya kompleks protein yang telah berikatan dengan antibodi spesifiknya tersebut akan dapat berikatan dengan antibodi lain yang telah mengandung biotin (antibodi sekunder). Selanjutnya diberikan substrat (misalnya ABTS atau TMB) untuk membuat terjadinya colorimetric reaction berdasarkan dari aktivitas avidin-horseradish peroxidase pada substrat yang berikatan dengan biotin pada antibodi sekunder. Hasil akhir dari reaksi tersebut adalah adanya perubahan warna cairan pada well microplate. Optical density produk hasil dari rangakaian metode ELISA ini diukur dengan menggunakan spectrophotometer.

Spectrophotometer adalah sebuah alat yang dapat mengukur jumlah dari cahaya yang menembus sumuran dari microplate. Kompleks antigen-antibodi yang kita buat pada well mcroplate akan memberikan perubahan warna pada cairan tersebut, sehingga akan memberikan optical density yang berbeda. Optical density dapat dinyatakan meningkat atau menurun berdasarkan pengenceran material standart, sehingga akan menghasilkan kurva dose-response yang nantinya akan digunakan untuk mengestimasi kadar protein tersebut.

Pada praktikum pelatihan ELISA ini akan dilakukan pengukuran terhadap kadar IL-6 dari sampel yang telah disediakan.

Tujuan

1. Melatih mahasiswa biomedik untuk dapat melakukan ELISA

2. Mengukur konsentrasi IL-6 dari sampel yang telah disediakan

Metode

Bahan penelitian:

1. Coating buffer

-       Na₂CO₃                         0.159 g

-       NaHCO₃            0.293 g

-       NaN₃                  0.02 g

-       Add H₂O            till 100 ml

-       Adjust pH 9.6

2. PBS (Phosphat Buffer Saline)

-       NaH₂PO₄           0.24 g

-       Na₂HPO₄           0.12 g

-       KH₂PO₄                         0.07 g

-       KCl                     0.68 g

-       Add H₂O            till 100 ml

-       Adjust pH 7.4

3. PBS-Tween (wash buffer)

-       PBS                   100 ml

-       Tween-20          50 μL

4. Blocking buffer (1% BSA)

-       BSA                   0.1 g

-       PBS                   10 mL

5. Stop solution (H₂SO₄ 2N)

-       H₂SO₄               0.55 mL

-       Add H₂O            till 10 mL

6. Sampel IL-6

7. Antibodi IL-6

8. Anti-Rabbit igG

Prosedur ELISA

1. Siapkan plate ELISA dan Plate Layout

Standart: 1 Sample: 2

Gambar 1 Plate Elisa

1-A: Blanko IL-6                 2-A: 3

1-B: 1 μg                             2-B: 12

1-C: 0,1 μg                         2-C: 16

1-D: 0,01 μg                       2-D: 9

1-E: 0,001 μg                      2-E: 14

1-F: 0,0001 μg                    2-F: 6

1-G: 0,00001 μg                 2-G: 5

1-H: 0,000001 μg               2-H: 4

2. Coating antigen

a. Serum: coating buffer = 1: 25 @ 100µl

b. BUngkus dengan alumunium foil

c. Inkubasi dalam suhu 40 selmalam

d. Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl             

3. Coating Blocking buffer (supaya menutupi antigen yang tidak kita inginkan)

a. 1% BSA-PBS @ 100 µl

b. Bungkus dengan alumunium foil

c. Inkubasikan selama 1 jam pada suhu ruangan

d. Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl

4. Coating antibody primer (mengikat antigen spesifik yang sudah kita coating sebelumnya)

a. Mouse anti-human antibody : Blocking Buffer = 1: 500 @ 100 µl

b. Bungkus dengan alumunium foil

c. Inkubasikan selama 2 jam pada suhu ruangan

d. Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl

5. Coating antibody sekunder (untuk mengikat antibody spesifik yang supah kita coating sebelumnya, dan memberikan tempat untuk molekul pewarnanya)

a. Rabbit anti-mouse IgG Biotin conjugate : PBS = 1: 1000 @ 100 µl

b. Bungkus dengan alumunium foil

c. Inkubasikan selama 1 jam pada suhu ruangan

d. Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl

6. Coating enzim

a. SAHRP : PBS = 1:1000 @ 100 µl

b. Bungkus dengan alumunium foil

c. Inkubasikan selama 1 jam pada suhu ruangan

d. Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl

7. Substrat dan Stop solution

a. Teteskan substrat Tetramethyl benzydine (TMB) @ 50 µl

b. Inkubasi selama 30 menit dalam suhu ruangan

c. Tambahkan H2SO4 2N @ 50 µl

d. Inkubasikan selama 10 menit pada suhu ruangan

8. Baca dengan ELISA reader (Spectrophotometer) pada λ 450 nm 3 kali tiap 5 menit

Hasil

1. Standart IL-6

Standard	Conc. (ng/ml)	OD
1	1000	0.773
2	100	0.298
3	10	0.076
4	1	0.181
5	0.1	0.169
6	0.01	0.248
7	0.001	0.679

Kurva standart disebut baik apabila R²-nya mendekati 1. Pada hasil ELISA ini didapatkan nilai R² pada kurva 0,4823, akibatnya kurva standart ini tidak dapat digunakan. Oleh karena itu digunakan kurva standart lain untuk membantu pembelajaran menghitung kadar IL-6 meskipun seharusnya menggunakan standart lain juga tidak diperbolehkan.

2. Satandart uPAR

Standard	Conc. (ng/ml)	OD		Avg OD	log conc.	log O.D
1	0	0.076		0
2	62.5	0.095	0.112	0.0275	1.795880017	-1.56067
3	125	0.129	0.139	0.058	2.096910013	-1.23657
4	250	0.186	0.194	0.114	2.397940009	-0.9431
5	500	0.285	0.302	0.2175	2.698970004	-0.66254
6	1000	0.48	0.497	0.4125	3	-0.38458
7	2000	0.864	0.971	0.8415	3.301029996	-0.07495
8	4000	1.841	1.869	1.779	3.602059991	0.250176

Pada standart uPAR tersebut, diketahui R²-nya 0,9994 yaitu mendekati 1, oleh karena itu kurva ini merupakan kurva yang dapat diterima untuk menghitung kadar sampel dalam pembelajaran ini. Namun seharusnya menghitung kadar IL-6 dengan standart zat lain tidak diperbolehkan

3. Korelasi sampel

Nama Sampel	Absorbansi	Log Absorbansi	Log Konsentrasi	Konsentrasi (dalam pengenceran)	Real Konsentrasi
3	0.07	-1.15490196	2.196853996	157.3453801	3933.634503
12	0.166	-0.779891912	2.57718873	377.7363072	9443.40768
16	0.058	-1.236572006	2.114024334	130.0242431	3250.606077
9	0.888	-0.051587034	3.315834651	2069.353333	51733.83333
14	0.121	-0.91721463	2.437916197	274.10452	6852.612999
6	0.044	-1.356547324	1.992345514	98.25293076	2456.323269
5	0.044	-1.356547324	1.992345514	98.25293076	2456.323269
4	0.052	-1.283996656	2.065926312	116.3928526	2909.821314

Dari perhitungan menggunakan kurva uPAR diatas, didapatkan konsentrasi IL-6 (dalam nano liter) pada masing masing sampel.

Diskusi

Pada pelatihan penelitian ini secara garis besar langkah-langkah ELISA sudah dilakukan dengan teratur dan semua peserta telah mengetahui dasar teori dan prosedur dari ELISA ini, namun didapatkan ketidak akuratan pada hasil standart IL-6, hal tersebut dikarenakan pipetting yang tidak konsisten, karena pipetting dilakukan oleh oleh masing-masing peserta pelatihan. Masing-masing peserta memiliki keakuratan yang berbeda dalam pipetting sehingga mungkin terdapat kesalahan pipetting oleh sebagian peserta. Selain itu pada saat washing dengan cara menghentakkan plate ELISA gengan tegas, kekuatan dari para peserta pelatihan juga berbeda, sehingga kemungkinan peserta yang memiliki kekuatan lebih, secara tidak sengaja terlalu kuat saat menghentakkan dan sebagian ikatan antigen-antibodi yang telah ter-coating dapat terlepas dan terbuang. Oleh karena itu metode ELISA seharusnya dilakukan oleh 1 orang saja sehingga keakuratan dan kekuatan dalam melaksanakan langkah-langkah ELISA akan stabil.

Karena tidak dapat diperoleh standart IL-6 yang akurat, maka untuk melanjutkan pelatihan yaitu cara menghitung kadar IL-6 dari sampel, maka diambilah standart dari sampel lain (uPAR) yang memiliki tingkat keakuratan tinggi. Seharusnya standart yang digunakan adalah standart yang di-running bersama dengan sampel pada saat yang bersamaan. Meskipun zat yang diukur sama, kita tidak boleh menggunakan standart suatu zat dari ELISA sebelumnya untuk digunakan pada ELISA yang sedang di-running, apalagi menggunakan standart zat yang berbeda. Namun tujuan utama ELISA ini adalah sebagai pelatihan sehingga lebih mementingkan pada cara dan prosedur yang dilakukan saat ELISA termasuk cara menghitung kadar suatu zat. Dengan menggunakan standart uPAR, hasil absorbansi IL-6 dapat dimasukkan ke dalam persamaan kurva standart uPAR sehingga dapat diketahui kadar Il-6 pada masing-masing sampel.

Untuk menghitung kadar dari IL-6 digunakan cara regresi linier, sama dengan cara yang digunakan untuk elektroforesis, namun persamaan garis yang dipakai pada standart adalah persamaan logaritma. Persamaan garis yang dipakai ada bermacam macam, tergantung dari kit yang kita gunakan atau dengan pendekatan hubungan titik-titik hasil spectrophotometri menjadi sebuah persamaan garis. Pertama, absorbansi atau optical density IL-6 hasil spectrophotometri dibuat pada tabel pada Ms. Exel. Selanjutnya dibuat logaritma dari data absorbansi tersebut dan dibuat logaritma dari konsentrasi standart. Kemudian dibuatlah persamaan garis terhadap Log absorbansi dan Log konsentrasi dengan sumbu X sebagai Log konsentrasi dan sumbu Y sebagai Log absorbansi. Absorbansi dari sampel selanjutnya juga dibuat logaritmanya. Dengan persamaan garis tersebut, dapat dihitung dan diketahui logaritma konsentrasi dari IL-6. Berikutnya dibuat anti-logaritma dari Log konsentrasi IL-6 yang sudah didapatkan, sehingga akan diketahui konsentrasi IL-6. Namun konsentrasi IL-6 ini adalah konsentrasi dalam pengenceran 25 kali, sehingga untuk mengetahui konsentrasi IL-6 sesungguhnya dalam sampel, konsentrasi yang telah kita dapat ini dikali 25. Dari perhitungan regresi linier tersebut dapat diketahui konsentrasi IL-6 pada masing-masing sampel.

Kesimpulan

1. Mahasiswa biomedik dapat melakukan prosedur ELISA dengan baik dan menghitung kadar IL-6 dengan menggunakan regresi linier pada pelatihan prosedur ELISA ini

2. Diketahui kadar IL-6 pada sampel 3 adalah 157,35 ng/ml, sampel 12 adalah 377,74 ng/ml, sampel 16 adalah 130,02 ng/ml, sampel 9 adalah 2069,35 ng/ml, sampel 14 adalah 274,1, sampel 6 adalah 98,25, sampel 5 adalah 98,25, dan sampel 4 adalah 116,39 dengan menggunakan standart uPAR.